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如何大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞（下）

更新時(shí)間：2021-09-23 瀏覽次數(shù)：3022

近年來，我國的生物技術(shù)飛速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)形成規(guī)模化，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式、細(xì)胞工廠5種技術(shù)形式。

連續(xù)式培養(yǎng)

連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。

該模式是將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。

理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。

在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞生長速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺維持在一個(gè)較低的水平，從而使它們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。

然而，在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除，細(xì)胞活性高，最終細(xì)胞密度得到提高，可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并不提高；尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷地稀釋，營養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。

連續(xù)式培養(yǎng)的不足：

由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染，在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；

對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高，多數(shù)采用攪拌式生物反應(yīng)器，也可采用管式反應(yīng)器。

連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)：

細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長；

產(chǎn)物體積不斷增長；

可控制衰退期與下降期。

灌注式培養(yǎng)

灌注式培養(yǎng)，也稱灌流式培養(yǎng)，是連續(xù)式培養(yǎng)常見的方式。

灌注式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。

它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取出培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。

灌注式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式：

(1)攪拌式生物反應(yīng)器

用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。

中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小相對分子質(zhì)量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和相對分子質(zhì)量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)。

近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。

(2)固定床或流化床生物反應(yīng)器

固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚酯纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。

流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體順粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。

圖 01

片狀載體在生物反應(yīng)器上使用的一般流程

灌注式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)10⁷-10⁹/ml，從而較大地提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。

連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定地處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低。

反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高。

產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。

連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。這種方法最大的缺點(diǎn)是污染幾率較高以及長期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性、規(guī)模放大過程中工程問題。

針對這些使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞中的一些痛點(diǎn)，搏旅提供了一系列的解決方案，采用理念與技術(shù)，打造出一批批精品的生物反應(yīng)器，為客戶提供反應(yīng)器和技術(shù)服務(wù)。

圖 02

固流床細(xì)胞生物反應(yīng)器

細(xì)胞工廠培養(yǎng)

細(xì)胞工廠是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。

更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。

丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠系統(tǒng)。可用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì)改變細(xì)胞生長的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1、2、10和40層的培養(yǎng)體系，使放大變得簡單易行，低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測試保證有利于細(xì)胞貼附和生長。

同時(shí)，與NUNC的細(xì)胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，從而大大地減低勞動(dòng)強(qiáng)度和密集度。這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。

圖 03

細(xì)胞工廠系統(tǒng)

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